小型猪的应用主要集中在动物疾病模型和器官异种移植两大领域,涉及肿瘤、心血管病、代谢病、遗传病、皮肤烧伤和新药安全性评价等,甚至开展了转基因猪研究,为人类异种器官移植服务。
一、心血管系统疾病的研究应用
小型猪心脏及冠状动脉存在缺失先天并行血液供给系统,以及卵圆孔没有封闭的情况,与人类十分相似,其生理生化指标也与人类相似,因此小型猪被视为医疗器械或者心血管疾病药物的最佳实验动物模型。
小型猪心脏及冠状动脉存在缺失先天并行血液供给系统,以及卵圆孔没有封闭的情况,与人类十分相似,其生理生化指标也与人类相似,因此小型猪被视为医疗器械或者心血管疾病药物的最佳实验动物模型。
在心血管系统疾病研究中,应用最多的实验用小型猪模型是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)模型,该模型构建方式分为人工高脂高胆固醇诱导和基因编辑构建自发性小型猪AS模型。李艳君等持续饲喂巴马小型猪高脂高胆固醇饲料3个月,小型猪AS指数达3.8以上,并维持了3个月,成功构建动脉粥样硬化巴马小型猪模型。基因构建自发性AS模型中,大部分为敲除低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)基因、脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)基因。通过敲除LDLR基因,使小型猪血液中的低密度脂蛋白胆固醇lowdensitylipoprotein cholesterol, LDL-C)值升高,从而诱发AS症状。DAVIS等采取敲除LDLR基因,然后通过体细胞移植到尤卡坦小型猪,再经过6个月的高脂饲喂,成功构建尤卡坦小型猪AS模型。在尤卡坦小型猪的腹主动脉和冠状动脉中均发现了不同程度的动脉粥样硬化。
高甘油三酯症是引起人类冠心病的最大因素。小型猪还被应用于高甘油三酯症模型的构建,基于该模型的研究发现,载脂蛋白CⅢ(apolipoprotein, ApoCⅢ)与甘油三酯密切相关,甘油三酯水平升高会显著降低ApoCⅢ酶的活性。在慢性心肌缺血的小型猪模型构建上,田玉龙等用五指山小型猪构建慢性心肌缺血病模型,对心力衰竭、心肺复苏后心肌代谢进行相关的评估,这对治疗心脏病研究具有十分重大意义。近年来,小型猪应用于医疗器械方面的研究主要集中在心血管系统疾病上,对小型猪品种没有特殊要求,但常选择体型稍大的小型猪进行相关研究。
二、内分泌系统疾病的研究应用
实验用小型猪在内分泌系统疾病方面的研究主要集中在构建糖尿病动物模型上,尤其是2型糖尿病(diabetes mellitus type 2, T2DM)模型构建。构建小型猪T2DM模型主要采取手术摘除胰腺、人工膳食诱导、人工药物诱导、基因工程及自然进化繁育等方法。
(1)手术切除胰腺是构建小型猪T2DM模型最早的方法,其缺点是所构建模型猪葡萄糖耐量低于正常且多尿等。
(2)人工膳食诱导是构建T2DM模型最简单有效的方法,一般利用高糖高脂饲料持续饲喂实验用小型猪,小型猪血糖长期偏高引起糖代谢异常,导致T2DM。
(3)人工药物诱导也是构建T2DM模型方法之一,而链脲佐菌素是人工诱导的常用药物。链脲佐菌素是一种具有烷基化特性的细胞毒性葡萄糖类似物,可通过葡萄糖转运蛋白2进入细胞。在细胞内,链脲佐菌素的亚硝基脲部分被切割,通过掺入烷基诱导DNA损伤。DNA损伤诱导多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶的激活以进行DNA修复,诱发一氧化氮和自由基的产生,最终导致坏死性β细胞死亡。LU等使用链脲佐菌素连续诱导法成功建立贵州小型猪T2DM模型。
(4)基因工程方法可用于量身定制小型猪模型。BREM等在1985年通过将原核DNA显微注射到受精卵母细胞中产生第一批转基因猪模型,但这种方法受到效率低和无法引入有针对性基因修饰的限制。WARR等在2019年通过基因工程技术,构建了许多用于糖尿病和肥胖研究的定制猪模型。
(5)由自然进化形成的小型猪模型比较少。顾为望团队曾用此方法建立了高血糖系的巴马小型猪模型。
三、消化系统疾病的研究应用
小型猪为杂食性动物,其消化系统与人的消化系统有一定的差异性,但消化生理过程与人类十分相似。小型猪应用于肝脏代谢和肾脏代谢方面的研究较多。LIU等构建了巴马小型猪戊型肝炎(hepatitis E, HEV)模型;廖锦元等、周忠信等构建了肝硬化小型猪模型; 李晓栋等构建了巴马小型猪阻塞性慢性胰腺炎模型; 张华构建了部分肝脏切除及部分肝脏切除合并缺血的巴马小型猪模型; 李莹倩等以6月龄健康巴马小型猪公猪为研究对象,经过手术操作,建立巴马小型猪直肠脱垂动物模型,发现直肠脱垂不仅由单方面的组织局部病变导致,还与机体全身因素密切相关。
四、运动系统疾病的研究应用
小型猪的膝关节解剖结构和人的膝关节非常相似,其运动时膝关节屈曲动作跟人的也比较相近,可以作为研究人类膝关节疾病方面的动物模型。杨程等通过手术切除构建了膝关节软骨缺损五指山小型猪模型;吴清洪等构建了早期膝骨性关节炎藏香小型猪模型;ZHANG等构建了双膝关节软骨缺损贵州小型猪模型。
在运动系统疾病研究中,还有一些涉及神经系统跨学科的小型猪模型构建。YANG等利用转基因克隆技术,培育出世界上首个亨廷顿舞蹈症西藏小型猪模型,该小型猪由于脑神经元出现凋亡,出现舞蹈样运动及运动障碍。随后,YANG等用同样的方法,构建了人肌萎缩侧索硬化症的西藏小型猪模型,发现小型猪铜锌超氧化物歧化酶基因和反式激活反应-DNA结合蛋白基因发生突变。
五、器官异种移植的研究应用
小型猪在遗传学、解剖学和生理学方面与人类相似,因此是异种移植生物材料的最佳供体。尽管存在这种相似性,但猪和人之间存在相当大的系统发育距离,这可能会导致猪-人异种移植后人体免疫系统出现问题,发生排斥反应等,其中引起超急性排斥反应的主要碳水化合物是α-1, 3-半乳糖。MCGREGOR等通过基因编辑,将人的CD46基因转移到猪体内并成功表达,而接受转基因猪心脏移植后的狒狒存活达96天之久。
2022年1月7日,美国马里兰大学医院成功完成全球首例人类接受猪心脏移植手术。小型猪作为人类异种移植供体可能引发感染,其中包括很多人类易感的病原体,除了排异反应,逆转录病毒复制也是亟待解决的问题之一。受益于基因编辑技术的重大创新,异种移植研究已成为可能,但应用于临床仍然存在较大的伦理与疾病传染风险。因此,小型猪器官异种移植的应用,是美好前景与复杂风险共存的。
六、肿瘤方面的研究应用
SIKORSKA等构建了人家族性腺瘤性息肉病小型猪模型;结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是近年来数据剧增并年轻化的人类癌症,而腺瘤性 结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli protein, APC)是Wnt通路的负调控因子,能够抑制肿瘤发生,其功能被破坏是导致CRC发生的主要因素。ANDREWS等从1头2.5岁患有恶性肿瘤的近交母猪上采集与小鼠组织相容的淋巴母细胞,亚克隆移植到免疫功能低下的小鼠中,构建了可移植肿瘤的小鼠模型。乳腺癌基因1(breast cancer 1, BRCA1)是肿瘤抑制因子,是调控乳腺发生变异的重要因子。LUO等采用基因编辑技术,敲除尤卡坦小型猪的BRCA1等位基因,但这些小型猪在18天内陆续死亡,其死亡机制并不明确。与大鼠、小鼠等其他实验动物相比,小型猪大脑生理结构、生物学指标等和人类非常相似,是人类脑肿瘤相关的代谢、影像和治疗研究的理想动物模型。BOURNEUF构建皮肤黑色素瘤小型猪模型,揭示了肿瘤发生过程中的体细胞变化及主要的细胞学改变,阐明内源性逆转录病毒黑色素瘤形成,以及适应性免疫反应。赵勇等采用免疫抑制剂处理,构建了人脑胶质瘤小型猪模型,肿瘤发生率达90%以上,生长特征均符合肿瘤特征,为人脑胶质瘤影像筛选和治疗提供实验工具。由于实验动物肿瘤模型个体差异大、构建时间长、发生概率不易控制,基于模型探索的治疗方法和药物影响等仍难以在人类上复制,故利用小型猪建立肿瘤模型相对较少。
七、其他方面的研究应用
与其他模式动物相比较,小型猪牙齿的解剖结构、排列形态、数目、生理功能及病理机制与人类更相似,小型猪作为口腔模式动物已被广泛应用于口腔医学研究领域;有学者开展了构建危重类疾病小型猪模型相关研究,如张贺等成功建立巴马小型猪失血性休克模型,准确模拟临床患者失血性休克状态,为相关病例的处理提供参考;小型猪视网膜有1个富含锥感光细胞的黄斑区域,与人的视网膜十分相似,且眼睛大小、结构与人类也相似,相比啮齿类动物,小型猪是更好的眼睛动物模型,ROSS等构建了人视紫红质P23H突变的转基因小型猪模型,随后发现小型猪在3个月后出现了视力异常和明视的视网膜电图,这些症状和人的色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa, RP)症状非常相似,这为了解RP发病机理、寻求RP治疗方法提供重要的参考依据。